复旦大学电光源研究所

谢姝鸽  韩秋漪  张善端

关键词：微生物  紫外线  灭活剂量  灭活机理  光复活

　　紫外光（UV）按照波长范围可以分为UVA（315nm～400nm）、UVB（280nm～315nm）、UVC（200nm～280nm）和真空紫外VUV（100nm～200nm）四段，其中在杀菌消毒中使用最多、灭活作用最强的是UVC波段。紫外线杀菌消毒的主要机理是它能对微生物的遗传物质（核糖核酸RNA和脱氧核糖核酸DNA）产生光化学伤害。具体来说，当核酸被紫外线照射时会大量吸收紫外线，促使细胞体内合成大量的间二氮杂苯（主要构成为蛋白酶）及其异构体，从而破坏其中的分子结构，进而阻碍遗传物质的复制、转录以及蛋白质的合成，使微生物死亡^[1]。

　　相比其他消毒方法，紫外消毒属于纯物理消毒，具有简单便捷、广谱高效、无二次污染、便于管理和实现自动化等优点^[2]。随着各种新型紫外光源的推出，紫外消毒广泛应用于表面、空气、水体和食品的杀菌消毒，还可用于有害气体分解和螨虫杀灭，逐渐成为主流消毒方法之一^[3]。

1.1  微生物的种类

　　微生物种类不同，对应的紫外线最大吸收值也不同。研究发现，大肠杆菌的最大吸收波长为265nm，而隐孢子菌和噬菌体的最大吸收波长则分别为261nm和271nm，因此对应的灭活时间也不相同。例如，当低压汞灯发出的254nm紫外辐照度为30mW/cm²时，杀灭病毒、霉菌孢子、藻类细菌所需时间分别为0.1s～1.0s、1.0s～8.0s、5.0s～40.0s^[4]。

　　另外，不同微生物对紫外线的敏感度也存在差异，紫外灭活的效率依次为原虫、细菌、病毒，即紫外线对病毒尤其是腺病毒和轮状病毒的杀灭效果最差^[5]。董小平等^[6]发现，杀灭1×104个/mL的SARS病毒和腺病毒，所需UVC紫外剂量分别为162mJ/cm²和200mJ/cm²。

1.2  紫外剂量

　　紫外剂量在消毒过程中起着至关重要的作用。这里的紫外剂量是指达到一定程度的微生物灭活率时，对应的特定波长紫外线（一般是指254 nm UVC）的剂量，等于紫外辐照度与辐照时间的乘积^[7]。在紫外剂量相同时，不同的辐照模式对应的灭活效果一般也是不同的，实际应用中常通过选择高强度、短时间或者低强度、长时间来实现不同的消毒目标。理论上，灭活效果和紫外剂量成正比。在完全灭活之前，剂量越大，灭活率越高^[8]。需要说明的是，在实验中，通常用辐照前后微生物浓度比值的对数值lg（N/N₀）来表示灭活率，其中N₀为初始浓度，N为辐照一定时间后的存活浓度。具体来说，Lg-1对应灭活率为90%，Lg-2对应灭活率为99%，Lg-3对应灭活率为99.9%，Lg-4对应灭活率为99.99%^[9]。在不同的环境中，完全灭活的标准不同，对应的紫外剂量也不同。

1.3  紫外剂量与微生物光复活的关系

　　当紫外剂量充足时，微生物能够被彻底灭活。但在剂量不足的情况下，有很多被紫外辐照失活却未被彻底杀灭的微生物可凭借光的协助作用修复自身被破坏的结构。微生物在受到紫外线的照射时，内部结构均会受到损伤以致死亡，但所有生物对这种光伤害都有一定的修复能力，这也是紫外消毒的主要缺点所在。微生物被紫外辐照后造成的损伤能被特定波长光修复的现象称为光复活^[10]，其中的机制是经特定波长（一般指330nm～480nm）照射后，遗传物质DNA分子中的嘧啶二聚体，在无光照条件下会和一种光激活酶结合，这种酶可以在获得光能后被激活，并使紫外辐照合成的二聚体重新分解成单体。与此同时，光激活酶也从复合物中释放出来，后续可以继续重新执行修复功能^[11]。修复情况由微生物的种类和被紫外辐照灭活的程度决定，辐照的紫外剂量越高，修复间隔时间越长，修复能力越弱^[12]。

　　闫岩等^[13]通过实验得到了水中杀灭不同微生物所需的紫外剂量，如图1所示。从图1可知，杀灭肠杆菌和螺旋杆菌所需的紫外剂量较小，杀灭孢子所需的紫外剂量较大。

图1  灭活不同微生物所需紫外剂量^[13]

　　根据图1整理出不同微生物不同灭活率对应的紫外剂量见表1。可以得到：完全灭活（大）肠杆菌大约需要紫外剂量10mJ/cm²～20mJ/cm²，而螺旋杆菌和孢子则需要39mJ/cm²和73mJ/cm²左右的紫外剂量。这意味着在相同的辐照强度下，完全灭活螺旋杆菌和孢子所需的辐照时间大约是大肠杆菌的2倍～4倍。

表1  不同微生物不同灭活率对应的紫外剂量^[13]

　　冯娜^[14]通过紫外线杀菌动力学得出：

　　其中N₀为初始微生物浓度，N为紫外辐照后的微生物浓度，I为紫外强度，t为辐照时间，D为紫外剂量，即紫外线对微生物的杀灭效果与紫外剂量呈指数关系。实验中，一般规定病毒杀灭率达99.999%（1g-5）时可看作完全杀灭，细菌杀灭率达99.9%（1g-3）时可看作完全杀灭，由此得出的不同微生物杀灭对应杀灭所需的紫外剂量^[15]见表2。

表2  不同微生物被杀灭所需的紫外剂量^[15]

　　李梦凯等^[16]通过生物剂量法^[17]得到几种典型的微生物达到不同灭活率时所对应的紫外剂量。首先，在实验室采用准平行紫外光束装置测定受试微生物的剂量响应关系曲线；然后，将固定浓度的微生物溶液根据运行状况依次流经消毒系统，通过测定各组微生物的灭活率来对紫外消毒系统的灭活参数进行验证；最后，将实际消毒系统的杀灭结果与剂量响应曲线进行比对，从而得到消毒系统相应的紫外剂量，该剂量即为达到各等级灭活率的等效剂量。实验结果见表3，在相同灭活率下，枯草芽孢杆菌所需紫外剂量远大于大肠杆菌和T1、T7噬菌体。

表3  几种典型的受试微生物达到相应灭活率所需要的紫外剂量^[16]

　　朱红^[15]主要研究了紫外灭活对真菌和细菌影响的差异性。正常情况下，灭活真菌的难度远远大于细菌，这主要是二者细胞结构的差异导致的。具体来说，有三个方面：（1）真菌的细胞核外有核膜包裹，对真菌的遗传物质有更好的保护作用，这增加了紫外辐照破坏真菌DNA的难度；（2）真菌细胞壁的主要成分是几丁质，而细菌是肽聚糖，二者成分差异使得真菌细胞对紫外耐受性更强；（3）细胞器组成也是不同的，真菌除核糖体外，还有高尔基体、内质网、线粒体等多种细胞器，细胞结构复杂得多，所以其抗紫外辐照能力更强。除细胞结构差异以外，二者细胞尺寸也不同。细菌大小一般为0.5μm～5μm，而真菌一般为10μm～100μm，真菌体积远大于细菌，使得紫外穿透路径更长，完全灭活所需紫外剂量更大。最后，真菌相比细菌容易成团，紫外辐照难以穿透真菌团块后对内部进行作用，这也是对真菌的有力保护^[18]。

　　在实验中，DNA、蛋白质、三磷酸腺苷（ATP）均可作为判断细胞是否被灭活的成分依据。DNA是细胞的遗传物质，控制细胞的生长发育和运作机制，指导蛋白质合成，而蛋白质本身是细胞中含量最高的组成成分。要了解微生物的存活情况，既可以采用直观的平板计数法，也可以通过检测其DNA与蛋白质泄漏量来确定是否破裂死亡。同时，ATP作为生命活动的能量物质，其浓度的高低也可以作为微生物是否死亡的判断依据，灭活后细胞释放出的游离ATP的浓度在一定程度上反应了细胞的破坏程度。除上述的方法以外，扫描电镜照片可更加直接地观察到细胞表面在灭活前后的变化，还可与灭活数据相结合进行定量地比较分析^[19]。灭活率随紫外剂量变化的实验结果如图2所示。

　　由图2可见，四种真菌对紫外辐照的耐受性由弱到强依次为：木霉属、枝顶孢属、青霉属、枝孢属。同等紫外剂量下，前三者灭活率大致相同，但枝孢属灭活率明显较低，具体灭活数据见表4。从图2可以看出，当紫外剂量为40mJ/cm²时，木霉属灭活率最高，达到了98.45%，而枝顶孢属和青霉属的灭活率分别为93.08%和90.56%，这三者都达到了90%以上的灭活率，而枝孢属在此紫外剂量下的灭活率仅为26.68%，显著低于其它三种真菌。另外，对比四种真菌灭活率达到100%时所需的紫外剂量可以发现，木霉属仅需50mJ/cm²，枝顶孢属和青霉属则需要60mJ/cm²和80mJ/cm²。至于枝孢属，100mJ/cm²紫外剂量下的灭活率也仅为92.65%。实验同时对大肠杆菌也进行了紫外灭活，可以看到20mJ/cm²的紫外剂量就能使大肠杆菌的灭活率达到100%，进一步证明了紫外灭活真菌远比灭活细菌困难。

图2  紫外灭活四种真菌及大肠杆菌的差异性^[19]

表4  不同微生物不同灭活率对应的紫外剂量^[19]

　　赵琳^[20]采用大肠埃希氏菌作为细菌灭活效果指示菌，研究紫外消毒的灭活效果。如图3所示：紫外辐射对大肠埃希氏菌有很好的灭活效果，随着紫外剂量的增加，灭活率不断提高，在紫外辐射剂量为15mJ/cm²时，对数灭活率可达到4.55，即基本实现了完全灭活。

图3  不同紫外辐射剂量对灭活大肠埃希氏菌的影响^[20]

　　将图中数据整理得到表5，从中可直观看出，当紫外剂量达到4mJ/cm²以上时，99%的大肠埃希氏菌都会失去活性。

表5  大肠埃希氏菌不同灭活率对应的紫外剂量^[20]

　　另外，实验还研究了紫外辐射对核酸降解效果的影响，其中核酸降解效果仍由对数灭活率来衡量。通过测量紫外剂量分别为50mJ/cm²、100mJ/cm²、150mJ/cm²、200mJ/cm²、250mJ/cm²、300mJ/cm²、350mJ/cm²、400mJ/cm²时的定量PCR（聚合酶链式反应），发现紫外辐射对核酸降解效果远差于灭活效果，这也是紫外光复活产生的原因。在紫外辐射剂量为400mJ/cm²时，才可以达到Lg-3的核酸降解率。

　　景明等^[21]还对污水中的主要病原菌进行了解析，主要是大肠杆菌、沙门氏菌和分枝杆菌。并研究了紫外辐射对各种病原菌的灭活效应，实验表明紫外消毒剂量为60mJ/cm²时，大肠杆菌和沙门氏菌的灭活率可达到99.9%。相比较Ren等^[22]的紫外消毒对大肠杆菌灭活率影响的研究，当消毒剂量为60mJ/cm²时，大肠杆菌的灭活率可达99.99%。产生这种差异的原因可能是紫外消毒会受到水体中各种物质的影响，紫外光在水中透射率下降很大。另外，相同的紫外剂量下，分枝杆菌的灭活率均不足90%，这主要与其特殊的细胞结构有关，其细胞膜富含脂类，具有疏水性，从而使得分枝杆菌对外界环境的抵抗性较强，灭活难度较大。

　　现有研究结果表明，在达到相同的灭活率时，不同微生物对应的紫外剂量存在较大差异。藻类和原生动物所需的剂量较大，其次是霉菌孢子类。细菌和病毒基本在紫外剂量较小时，就已被完全灭活。了解微生物灭活的紫外剂量，有利于紫外消毒设备实现更大的灭活率，为进一步研发创新奠定了基础。

　　但在文献调研的过程中，也发现了一些问题。不同的实验环境下，使用不同的实验设备和实验方法，得到的实验结果往往存在较大的差异，无法提供一个可靠和稳定的参考值。另外，现在已有的研究大部分都是紫外在表面和水消毒领域的应用，而空气和食物等方面相关研究还很少，这应该可以成为未来的研究方向。

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